2002年，欧洲多名接受促红细胞生成素（EPO）皮下注射治疗肾性贫血的患者，陆续出现了严重的纯红细胞再生障碍性贫血（PRCA）——他们体内产生的抗药物抗体不仅中和了外源药物，还"误伤"了自身的内源性EPO，导致患者完全丧失了生成红细胞的能力。这起震动全球药监系统的安全性事件，让"抗药物抗体（Anti-Drug Antibody, ADA）"这个略显冷僻的免疫学概念，第一次真正进入了公众视野。

ADA究竟是什么？它为什么会威胁患者安全？我们又该如何检测它？这篇文章将从机制讲起，梳理ADA检测方法的发展脉络，详解目前主流的检测技术，并回顾几起因ADA引发严重安全性问题的经典案例。
 

抗药物抗体（ADA）是机体对治疗性蛋白质药物产生的特异性免疫球蛋白，可与药物结合并影响其药理特性，主要分为中和性抗体（NAbs）和非中和性抗体两大类：

• 中和性抗体：能结合药物的活性位点，直接阻断其与靶标的相互作用，从而影响疗效；
• 非中和性抗体：虽不直接干扰生物活性，但可通过形成免疫复合物改变药物的药代动力学特性。

  ADA的产生机制最初与首次开发上市的单克隆抗体（mAb）含有小鼠序列有关——这些鼠源片段被人体免疫系统识别为异物，从而引发免疫原性。为克服这一问题，生物工程领域连续成功开发了嵌合（小鼠-人）抗体、人源化抗体乃至全人源抗体。尽管免疫原性因此显著下降，但尚未被完全消除，ADA仍可能在所有类型的mAb治疗中出现。

  其基本过程可以概括为：治疗性抗体进入体内后被免疫系统识别为外源抗原；树突状细胞（DC）捕获并加工抗原，将其呈递给初始T细胞；抗原呈递与共刺激信号共同激活T细胞；活化的T细胞进一步刺激B细胞活化；B细胞最终分化为浆细胞，产生抗药物抗体。、
   

  
  图1 抗药物抗体的产生机制和与机体的相互作用 (1) 输入体内的治疗性抗体被免疫系统识别为外源抗原；(2) 抗原捕获与处理：DC细胞捕获治疗性抗体并将其抗原加工后呈递给Naive T细胞；(3)T细胞激活：通过抗原呈递和共刺激信号激活Naive T细胞，转化为活化T细胞；(4)B细胞活化：活化的T细胞进一步刺激B细胞活化，增强免疫反应。(5) 活化的B细胞分化为浆细胞（Plasma Cell），产生抗药性抗体（ADA）

  ADA为何重要

   

  01  对药物研发的影响

  ADA会对药物暴露、药代动力学特征、药效及毒性作用等多方面造成影响：

  ADA与药物结合，可能增加或减少药物清除、影响半衰期和组织分布，改变药物暴露水平和药代动力学特征，进而影响毒性评价及临床起始剂量的确定；

  中和抗体会中和药物活性，降低药效；

  ADA若与药物及具有相似表位的内源性蛋白结合，可能导致相应的内源蛋白缺陷综合征，引起对应毒性；

  对药物的免疫应答可能导致过敏反应、自身免疫等不良反应；

  ADA-药物免疫复合物的沉积可能引起免疫病理变化及相关不良反应。

   

  02  ADA检测的意义

  评估药物免疫原性：判断药物是否引发免疫反应及其对疗效的影响； 

  保障患者安全：及时发现过敏反应和免疫介导的不良反应；

   个性化治疗方案调整：帮助医生根据患者的免疫反应调整用药或剂量； 

  药物研发的关键环节：是临床研究中评估免疫原性的标准步骤，满足监管要求； 

  精准医疗与早期预警：为个体化治疗提供支持，及时发现免疫反应变化以规避严重不良事件

   

  ADA检测技术发展简史

   

  很少有人意识到，ADA检测技术的源头，其实与内分泌学史上一项诺贝尔奖级别的发现紧密相连。

  1956年，Solomon Berson与Rosalyn Yalow在研究接受牛/猪源胰岛素治疗的糖尿病患者时，意外发现这些患者血液中存在一种能与放射性标记胰岛素结合的"胰岛素结合球蛋白"——这正是历史上第一次被明确描述的抗药物抗体。为了定量这种结合现象，两人由此发展出放射免疫分析法（Radioimmunoassay, RIA），并于1960年正式发表完整方法学。RIA不仅成为此后数十年测定激素、药物浓度乃至抗体的金标准技术，Yalow也因此于1977年获得诺贝尔生理学或医学奖（Berson因已于1972年去世未能共享此荣誉）。可以说，"检测抗药物抗体"这件事，从一开始就与"发明一种全新的免疫检测技术"绑定在了一起。

  进入生物技术药物时代后，随着重组蛋白、单克隆抗体等大分子药物大规模上市，ADA检测逐渐从个别实验室的探索性工作，演变为药物研发中一套标准化、可验证的监管科学体系：

  2004年，Mire-Sluis等在《Journal of Immunological Methods》发表了首份关于宿主抗体检测免疫分析法设计与优化的行业推荐意见，为筛选/确证分层检测策略奠定基础；

  2007年，Gupta等针对中和抗体的细胞学检测方法提出了设计、优化与确认方面的建议；

  2008年，Koren等提出了基于风险的ADA检测与表征策略，同年Shankar等发表了关于ADA检测免疫分析法验证的系统性推荐，两篇文章共同确立了如今广泛沿用的"筛选-确证-滴度-中和抗体"四阶段检测框架；

  2014年，Shankar等在《AAPS Journal》上进一步统一了临床免疫原性评估与报告的术语体系，推动全球监管机构在这一领域的语言与标准趋同。

  
                                                                                     图2 ADA检测方法发展时间线

  这条脉络也解释了为何今天NMPA、FDA、EMA的指导原则会高度一致地采用"筛选-确证-表征"三阶段思路——它并非某一家监管机构的独创，而是全球产业界与学术界二十年协作沉淀的结果。

  监管视角下的ADA检测策略

  对于ADA的检测，NMPA、FDA、EMA的指导原则均从免疫原性检测流程维度，将其分为以下三个阶段，遵循标准化流程：

  筛选试验优先识别潜在阳性样本，需保证高灵敏度，通过阴性样本统计确定临界值； 确证试验验证阳性结果的特异性，采用竞争性抑制法，抑制率≥50%判定为真阳性，以排除非特异性干扰； 滴度测定通过倍比稀释确定抗体相对浓度，反映免疫反应强度； 中和抗体检测评估ADA对药物生物活性的影响，需基于药物作用机制设计，优先选择细胞法（cell-based）或功能相关检测方法； 其中，在已确定的阳性样品中，还应考虑增加抗体同种型、亚型及结合表位的表征检测。
  
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                                                                                        图3 免疫原性ADA检测策略流程图
  简单说，这套三/四阶段思路的形成顺序是：先有"筛选和确证必须分开做"的统计学认识 → 再有一批白皮书把分层检测和验证参数标准化 → 最后监管机构把这套已经成熟的行业共识固化成指导原则，NMPA是这条链条上最新、也是主动对齐国际标准的一环。
   

  cut point（阳性判断值）的统计学确定方法

  ADA检测本质上是在做"从一堆样本里挑出真正含有抗体的那些"这件事，而任何单一检测方法都很难同时做到"不漏检"（高灵敏度）和"不误判"（高特异性）——放宽阈值抓住更多真阳性，代价是混入大量假阳性（比如样本基质干扰、类风湿因子、补体等非特异性结合造成的信号）；收紧阈值排除假阳性，又可能漏掉真正的低滴度阳性样本。这和药物滥用检测里"先免疫筛查、再质谱确证"的逻辑其实是同一套思路——业内很早就意识到，与其追求一步到位，不如把这个矛盾拆成两步走：筛选试验故意设计得"宽进"，用阴性对照人群的信号分布，按统计学方法（通常取均值加1.645倍标准差，对应单侧5%的假阳性率）算出一个临界值（cut point），保证真阳性样本几乎不会被漏掉；紧接着用确证试验（最常见的是加入过量游离药物做竞争抑制）把那些因非特异性结合而"误入"筛选阳性的样本剔除出去，只留下真正针对药物的抗体。这一步统计学方法论后来被Devanarayan等在《Journal of Immunological Methods》上进一步系统化，成为业内计算cut point的标准参照。
  
  常用ADA检测方法
   

  
                                                                                         图4 常用ADA检测分析方法总览图
  
  
  01 直接/间接ELISA法

  直接法：将样品中的ADA固定（吸附或共价附着）到ELISA板上，加入酶标记抗体（如HRP或碱性磷酸酶标记）使其结合固定化ADA，再加入相应底物产生与ADA量成正比的信号。

  间接法：先固定ADA，再将原始生物制药剂加入板中，随后加入该抗原的二级酶标记形式，形成标记免疫复合物，产生与板上ADA数量成正比的信号。

  
                                                                                      图5 直接/间接 ELISA示意图
  
   

  02  桥联ELISA法

  桥接ELISA使用两种结合剂（通常均为靶药本身）分别结合ADA上的不同区域：一种结合剂包被于ELISA板上用于捕获ADA，另一种带有酶标记，与捕获的ADA结合后产生检测信号。如下图所示。 

  实例：某研究团队采用桥接ELISA测定法检测抗美妥珠单抗（Metuzumab，一种人鼠嵌合抗CD147单抗）的抗体：将药物包被于微量滴定板以捕获ADA，随后加入HRP标记的美妥珠单抗，并以TMB为显色底物，最终获得0.39 ng/mL的检测限，线性范围为0.39–50 ng/mL。
  
  03  电化学发光法（ECL/MSD）
   

  MSD（Meso Scale Discovery）是一种基于电化学发光（ECL）的多因子检测技术。其基本原理是将抗原或抗体固定在电极表面，加入待测样本，通过特异性结合形成抗原-抗体复合物；随后加入标记有电化学发光标记物的二抗，通过电化学反应产生发光信号，以发光强度定量检测样本中的抗体或抗原浓度。直接、间接、桥接ELISA的原理同样适用于ECL/MSD平台。具体原理和检测步骤如下图所示。

  MSD技术的优点是灵敏度高、动态范围宽、可同时检测多个指标，适合低浓度样本；但设备成本较高，操作相对复杂，更适合高通量、高灵敏度需求的场景。
  
                                                         图7 ECL/MSD技术原理
  
                                                                                      图8 ECL/MSD实验步骤
  降低ADA影响的策略
  结合行业共识，降低ADA影响的策略通常包括：在分子设计阶段通过去免疫原性表位改造、人源化/全人源化降低外源性；在制剂工艺上优化纯度、降低聚集体含量；在临床用药层面优化给药剂量、频率与途径，必要时联合免疫抑制治疗；在检测层面建立贯穿临床前到上市后的免疫原性监测体系，及早识别高风险信号。
  
  结语
  从1956年Yalow与Berson在胰岛素治疗患者血液中偶然发现的"结合球蛋白"，到今天覆盖筛选、确证、滴度、中和抗体表征的全流程监管科学体系，ADA检测走过了近七十年的历程。它既是一门实验技术，更是一套关乎患者安全的风险管理哲学——EPO、TPO类似物、英夫利西单抗与因子VIII的案例反复提醒我们：免疫原性从来不是临床前研究的"选做题"，而是贯穿药物全生命周期的必答题。