【引语】

　　药物、环境污染物、化学污染物等小分子检测是临床诊断、环境监测、食品分析等领域的重要课题。几十年来，免疫分析作为一种灵敏、简单、经济的检测方式，一直是靶标分析物定量检测的主要手段。免疫分析通常分为两大类，竞争性分析和非竞争性分析，其中非竞争性分析通常被称为夹心免疫分析。它们在免疫反应中使用的试剂量存在着本质上的不同。在竞争性免疫分析中，分析物与标记的(或固定的)分析物竞争有限的特异性抗体。相比之下，夹心免疫分析法可以基于过量的两种不同抗体结合分析物，提高分析的灵敏度、准确度和特异性。然而，夹心免疫分析需要分析物分子具有较大的体积，从而允许至少两种抗体与两种表位相结合。由于空间位阻，小分子不能同时被两种抗体结合，因此通常不使用夹心免疫分析法。由于小分子抗体的结合腔大多为穴状，小分子与抗体结合后大部分被包埋在结合腔内，导致第二个抗体无法与结合位点结合，从而无法建立夹心免疫分析法。半抗原−抗体复合物的X射线结构显示了小分子如何深埋在接触表面积为200−400 Å2的穴状结合位点，分析验证了这一假设。典型的小分子(如滥用药物、抗生素和农药)表面积仅有100−800 Å2，理论上不足以同时结合两种抗体。因此，夹心免疫分析法被广泛应用于蛋白质和多糖等大分子的检测，而竞争性免疫分析法则常用于小分子检测。

　　由于夹心免疫分析的优势，研究人员开发了小分子检测的替代方法，如基于抗异型抗体或抗独特型抗体的非竞争性免疫分析，固相共价表位固定化，抗体可变区片段和竞争性夹心免疫分析。然而，此类分析的实际应用受到了非常规抗体制备程序和复杂操作程序的限制。采用两种不同抗体对小分子进行直接夹心免疫分析的报道很少，仅有少数小分子建立了真正的夹心免疫分析法，即:雪卡毒素(1023 Da)、他克莫司(804 Da)、柚皮苷(580 Da)、波那替尼(533 Da)、土霉素(496 Da)和伊马替尼(494 Da)。对于一个小分子，目前还不知道如何评估建立夹心免疫分析法的可能性，确定允许两种抗体结合所需的分析物的表位距离可以为小分子的夹心免疫分析提供有用的线索。此外，抗体−分析物−抗体三元复合物在小分子夹心免疫分析中的分子识别机制尚未被探索，这是半抗原设计、抗体发现和夹心免疫分析建立所必需的结构信息。

　　本研究使用两种典型的半抗原表位，三聚氰胺(MEL)和对硝基苯胺(NIA)来解决这些问题，它们由1−14个烷烃链长的线性间隔臂连接，形成9种模型M−N分析物。以新设计的12个半抗原(6个MEL半抗原和6个NIA半抗原)为基础，分别制备两组MEL和NIA的mAb。通过多种mAb配对，研究了组合关联性并确定M−N分析物可以同时被两种不同的mAb结合的最小表位距离。采用分子对接、分子动力学和表面等离子体共振(SPR)等方法，进一步研究了抗体−分析物−抗体识别在夹心免疫分析中的分子机制。最后，通过使用具有大表位的典型链状分子，磺胺−诺氟沙星(SBA−NOR)偶联物，作为新型模式分析物，及一种真实环状分析物，阿维菌素(ABM)，验证了本研究的结论。

【内容介绍】

1.

　　本研究的目的是探索小分子夹心免疫分析中分析物的最小表位距离。选择MEL表位和NIA表位这两个半抗原表位，并通过不同长度的线性链状间隔臂来模拟表位距离。因此，设计了一个模式分析物库，包括9种具有1−14个甲基间隔臂的化合物，两端分别为MEL−表位和NIA−表位，并将其命名为M−N分析物(MN1−MN9)，其长度依次增加(图1a)。

　　图1.M−N分析物和半抗原的化学结构。(a)由MEL表位和NIA表位(上)组成的9个M−N分析物(下)示意图，表位距离从2.4到19.0 Å (b)不同间隔臂长度的MEL半抗原的化学结构。半抗原M1(n=1)，M2(n=3)，M3(n=5)，M4(n=7)，M5(n=9)，M6(n=11) (c)不同间隔臂长度的NIA半抗原的化学结构。半抗原N1(n=0)，N2(n=2)，N3(n=4)，N4(n=6)，N5(n=8)，N6(n=10) (d)MN3−Me的化学结构

　　具有不同识别特性的抗体对于通过抗体对筛选来成功建立夹心免疫分析具有相当重要的意义，能够显著影响两个表位最小距离的确定。由于靶标分析物完全暴露于免疫系统对于诱导高特异性抗体至关重要，为了获得针对MEL−表位和NIA−表位的具有尽可能多的识别特性和多样性的抗体，在表位和载体蛋白之间建立半抗原间隔臂。设计了两组新的半抗原，并命名为MEL半抗原(M1−M6)和NIA半抗原(N1−N6)(图1b,c)。这些半抗原以两个亚甲基间隔臂的长度均匀增加，以产生对MEL−表位或NIA−表位具有不同识别特性的抗体群组。

　　在全合成之前，通过计算化学获得了所有设计的M−N分析物的尺寸。计算结果表明，最小结构MN1的表位距离为2.4 Å的，表位距离依次增加，最大结构MN9的表位距离为19.0 Å(图1a)。

　　由于半抗原不能被免疫系统有效识别，无法诱导后续抗体反应，因此首先将半抗原偶联到载体蛋白上。所有半抗原的羧基均与牛血清白蛋白(BSA)偶联作为免疫原，与卵黄蛋白(OVA)偶联作为包被抗原，来筛选血清及生产单克隆抗体。如前所述，MEL半抗原−BSA和NIA半抗原−BSA的偶联比分别被控制在19.3−23.6和9.0−13.2的适当范围内，并成功地通过基质辅助激光解吸和电离飞行时间质谱进行了表征。

2.

　　每个半抗原−BSA分别免疫10只BALB/c小鼠，以21天为间隔周期，免疫3次。半抗原M1−M6和N1−N6免疫12组小鼠的抗血清从第二次免疫开始监测。以MEL或NIA为分析物，采用ncELISA和ciELISA测定抗体效价和亲和力。在本研究中，抗体效价定义为ODmax在1.5−2.0之间的抗血清稀释度，而抗体亲和力表示为MEL或NIA浓度为10 μg/mL时的抑制率。

　　简而言之，抗体效价或抗体亲和力越高，表明抗体反应越强。所有具有不同间隔臂长度的半抗原在所有小鼠中都产生了对MEL或NIA的特异性抗体反应。此外，抗体反应水平主要取决于表位通过间隔臂暴露于免疫系统的程度。本研究旨在产生最大限度地识别MEL−表位和NIA表位的单克隆抗体，以促进M−N分析物的夹心免疫分析的建立。因此，从所有组中选择对MEL或NIA具有最高亲和力的小鼠来生产mAb，其中，由半抗原M1、M5和M6制备的单克隆抗体由于效价低和亲和力差而失败。共获得17株mAb，其中MELmAb6株，NIAmAb11株。具体而言，具有中等间隔臂长的半抗原M3和M4诱导的单克隆抗体与MEL具有相似的亲和力，IC50值为16−79 ng/mL。半抗原N3和N4单克隆抗体对NIA具有较高的亲和力，IC50值在81−601 ng/mL之间，比间隔臂长或短的半抗原N1、N2、N5和N6单克隆抗体的IC50值高近2−67倍。

3.M−N

　　为了建立M−N分析物的夹心免疫分析法，对具有不同识别特性的6种MEL单克隆抗体和11种NIA单克隆抗体进行配对检测，。针对9种模型M−N分析物共产生了1188对单克隆抗体，每个M−N分析物有132对单克隆抗体。由于MEL单克隆抗体作为夹心免疫分析的捕获抗体具有更高的OD值，NIA单克隆抗体被用作后续夹心建立的检测抗体。当M−N分析物为100 μM时，单克隆抗体配对结果如图2a,b所示。对表位距离较短的模式M−N分析物建立夹心免疫分析的成功率非常低;与表位距离为8.8 Å的MN5相比，几乎所有单克隆抗体对MN1−MN4的OD值都非常低(图2b,c)。结果表明，捕获和检测抗体之间存在空间位阻。当分析物的表位距离低于8.8 Å时，无法形成稳定的抗体−被分析物−抗体三元复合物，导致夹心免疫分析建立失败。尽管如此，对于检测到S/N>2.1的MN1−MN4，仍然有少量如MN1的7A3和17B3(S/N=2.9)的mAb抗体对仍然具有功能，这是迄今为止描述的最小分析物的夹心免疫分析(图2)。MN1抗原表位距离为2.4 Å，分子量为304 Da，成功的夹心免疫分析表明，通过仔细筛选和广泛配对mAb，可以实现两个mAb同时结合到一个极小的分析物上。对于表位距离至少为13.9 Å的分析物MN7−MN9，超过90%的mAb对能够建立高效夹心免疫分析，这表明大多数mAb抗体对能够成功同时结合。值得注意的是，在所有模式M−N分析物中都观察到存在不成功的单克隆抗体对，这表明生产具有不同识别特性的单克隆抗体对于建立小分子夹心免疫分析是必要的。

　　图2.已建立的MN1−MN9夹心免疫分析中mAb的组合 (a)设计的夹心免疫分析法示意图(左)和颜色界限的OD值(右) (b)基于mAb配对建立的MN1−MN9夹心免疫测定法获得的OD值。从左到右列的MELmAb和从上到下列的NIAmAb根据其半抗原间隔臂长由短到长排列 (c)允许夹心免疫测定的mAb配对百分比是表位距离的函数

　　来自具有长间隔臂的半抗原的单克隆抗体应该具有很深的结合腔，在大多数情况下不仅可以识别分析物表位，还可以识别间隔臂。不论使用何种捕获抗体，来自半抗原N5和N6的7F2、1E2和2F5单克隆抗体都在很大程度上阻碍了所有mAb抗体对的夹心免疫分析，这表明具有深结合腔的mAb阻碍了分析物的两种mAbs同时结合(图2b)。相反，具有短间隔臂的半抗原诱导的mAb具有较浅的结合腔，由于靶标分析物的部分暴露，主要识别MEL或NIA的部分表位。半抗原中间隔臂最短的N1的10A9 mAb抗体对和MEL 6A8 mAb抗体对可以同时与MN4−MN9结合，表现出mAb较深结合腔的优势。尽管如此，具有中等间隔臂长度的半抗原N1和N2单克隆抗体的整体夹心形成率远低于半抗原N3和N4单克隆抗体。结果进一步表明，应避免使用具有超长或短间隔臂的半抗原，以产生合适的抗体，建立有效的小分子夹心免疫分析。

4.M−N

　　选择半抗原M4的mAb 7A3和半抗原N4的mAb 17B3对MN1−MN9进行夹心免疫检测。为了评估分析物表位距离对免疫分析性能的影响并确定夹心免疫分析的合适分析物表位距离，分别基于7A3和17B3建立了相应的MN1−MN9竞争性免疫分析(图3a,b)。比较竞争免疫分析和夹心免疫分析的检测限(LOD)、检测范围和特异性。随着M−N分析物表位距离从2.4 Å增加到13.9 Å，基于7A3的竞争性免疫分析对MN1−MN7的LOD值逐渐从0.2降低到0.001 nM，并且观察到最长的M−N分析物MN8和MN9(表位距离分别为16.4 Å和19.0 Å)的LOD值增加(图3c)。同样，基于17B3的竞争免疫分析的LOD值在表位距离为2.4−19.6 Å的MN1−MN9中逐渐增加，然后下降(图3d)。半抗原M4和N4诱导的7A3和17B3对M−N分析物具有明显的亲和力差异，表明mAbs更可能对间隔臂表现出很大的共同识别。

　　图3.(a)基于抗MEL(左)或NIA(右)单克隆抗体的模式分析物的竞争性免疫分析和(b)基于模型分析物的两种不同单克隆抗体的夹心免疫分析示意图 (c)针对MEL、MN1−MN9的竞争免疫测定法和基于mAb 7A3的类似物的标准曲线 (d)针对NIA、MN1−MN9的竞争免疫测定法和基于mAb 17B3的类似物的标准曲线 (e)针对MN1−MN9、MEL、NIA和MN3−Me的夹心免疫测定法，使用mAb 7A3作为捕获抗体，mAb 17B3作为检测抗体

　　对于M−N分析物的夹心免疫分析如预期的那样，基于7A3−17B3的夹心免疫分析对所有M−N分析物产生了显著的剂量依赖信号(图3e)。结果表明，竞争免疫分析和夹心免疫分析对M−N分析物的灵敏度取决于分子的长度。因此，适当的分子长度可能有助于获得高灵敏度。对于表位距离短至6.3 Å的MN1−MN4竞争免疫测定法和夹心免疫测定法都显示出低灵敏度，竞争性免疫测定法对分析物的短表位距离更灵敏(图3)。即使在高浓度(100 μM)的分析物中，夹心免疫分析法也仅检测到MN1−MN4的微弱的信号。MN1−MN5的夹心免疫分析的LOD比竞争性免疫分析的LOD至少低3个数量级，这表明由于空间位阻，表位距离低于8.8 Å(MN5)的小分子不太可能被夹心免疫分析灵敏地检测到。相比之下，夹心免疫分析的LOD非常低，为0.00035~0.9 nM，对MN6~MN9的检测范围比相应的竞争免疫分析更广(LOD为0.001~38.8 nM)。这些结果表明，小分子夹心免疫分析对表位距离为11.6~19.0 Å的MN6~MN9具有较高的灵敏度和检测范围。在尽可能避免空间位阻的情况下，夹心免疫分析法的灵敏度更高，检测范围更广，因此优先使用它来检测小分子。

　　此外，为了评估这两种免疫分析形式的特异性，通过在NIA表位上引入一个额外的甲基，在MN3的基础上合成了一种名为MN3−Me的M−N分析物的新结构类似物，如图1d所示。表S5结果表明，基于两种mAb的竞争免疫分析法能够以与MN3相当的灵敏度检测MN3−Me，而夹心免疫分析法即使在100 μM也不能识别此类似物。该夹心免疫分析法使用了两种不同的单克隆抗体，对靶标分析物具有高特异性，为后续的实际应用提供了较高的准确性。

　　表S5.a使用单抗7A3对模型分析物进行竞争性免疫分析 b使用单抗17B3对模型分析物进行竞争性免疫分析 c使用单抗7A3和17B3对模式分析物进行夹心免疫分析 d夹心免疫法检测MN3类似物阴性

5.

　　为了进一步解释本研究中小分子夹心免疫分析所利用的抗体−分析物−抗体识别的科学基础，在抗体测序后，通过分子对接和分子动力学对典型M−N分析物复合物中的7A3−17B3、7A3−10A9和7A3−7F2mAb对进行结构研究。与抗体−抗原二元复合物的对接不同，很少有用于构建抗体−分析物−抗体三元复合物的方法。根据先前在蛋白水解−靶向嵌合体(PROTAC)方面的经验，我们研究了小分子夹心免疫分析中的抗体−被分析物−抗体三元复合物。

　　首先测定7A3−17B3共享结合腔中MEL和NIA之间的距离，用白色表面表示(图4a)。确定了与7A3−17B3共享结合腔的理论表位距离为9.2 Å，这意味着在这种情况下可以避免两个单克隆抗体之间的空间位阻。随后，不同表位距离的MN1−MN9被叠加到具有扩展构象的7A3−17B3的共享结合腔中。结果表明，表位距离为2.4−6.3 Å的MN1−MN4太短，无法叠加在共享的结合腔上，使用这些M−N分析物无法形成稳定的抗体−分析物−抗体三元复合物(图4b)。当MN1−MN4同时与两种单克隆抗体结合时，产生空间位阻，因此只能实现弱夹心免疫分析(图2b)。将与7A3−17B3共享结合腔的距离相当的表位距离为8.8 Å的MN5叠加在共享结合腔上，成功生成初始三元复合物。分子动力学研究表明7A3−MN5−17B3三元配合物构象稳定，均方根偏差(RMSD)在60~100 ns内为0.6 Å(图4c)。因此，通过实验和分子动力学研究证明，分析物表位距离为8.8 Å是建立小分子高成功率的夹心免疫分析的最短表位。

　　图4.分子对接和分子动力学研究夹心免疫检测中的分子识别机制。(a)抗体−抗体对接后，基于与MEL或NIA单抗体对接的初始构象，在7A3和17B3之间形成一个共享的结合腔(白色表面)(左) (b)MN1、MN5、MN7、MN9在7A3、17B3组成的共享结合腔中的重叠图。MN5可以包含在共享的结合腔中，而MN1−MN4太短，无法同时进入两种单克隆抗体的结合腔(右)。三元配合物的相互作用(c)7A3−MN5−17B3，(d)7A3−MN7−17B3，(e)7A3−MN9−17B3，(f)7A3−MN7−10A9，(g)7A3−MN7−7F2;捕获抗体(左)和检测抗体(右)分别用橙色和蓝色标记。

　　在上述夹心免疫分析实验中(图2和图3)，基于7A3−17B3的夹心免疫分析对MN5的灵敏度明显优于MN1−MN4，但远差于MN6−MN9，说明分析物的表位距离对夹心免疫分析的灵敏度至关重要。然后，研究了使用相同7A3−17B3 抗体对的MN5、MN7和MN9的夹心免疫分析的分析物表位距离与灵敏度之间的相关性。在实际结合过程中，当MN5同时被7A3和17B3结合时存在空间位阻，夹心免疫分析的灵敏度较低，LOD为265.4 nM(图2)。因此，分析了7A3−MN5−17B3三元复合物的识别机制，以深入了解其相互作用。复合物的结合腔主要由7A3的G307以及17B3的R55和N40提供的氢键维持。对于表位距离13.9 Å的MN7，在最大程度上降低了空间位阻对夹心免疫分析法灵敏度的影响(图4c)。由7A3的Y379、D327、E319、L439和S370以及17B3的Y210、Y212和Y152的常规氢键和疏水力维持的7A3−MN7−17B3三元复合物的夹心免疫分析最灵敏，LOD为0.00035 nM(图4d)。NIA−表位与7A3的S370之间由半抗原M4形成氢键，这表明7A3−MN7的结合腔比7A3−MN5更紧密。因此，与7A3−MN5−17B3复合物相比，相互作用力的增强使7A3−MN7−17B3复合物更加稳定，提高了其在夹心免疫测定中的灵敏度。MN9的表位距离最长，为19.0 Å，在夹心免疫分析中灵敏度比MN7低2500倍。经过分子动力学研究，在20 ns时得到了预期的稳定三元复合物7A3−MN9−17B3。夹心免疫分析对MN9的灵敏度较低，LOD为0.9 nM，这可能是因为MN9的表位距离较长，灵活性较高，增加了两种mAb末端之间的拉伸程度(图4e)。7A3−MN9−17B3复合物的0.6Å的RMSD高于7A3−MN7−17B3复合物的0.4 Å，进一步表明分析物的长表位距离可能并不总是有利于具有高灵敏度的夹心免疫分析。应考虑由长柔性链引起的分析物表位折叠，建立用于小分子的稳定的夹心免疫分析。这些结果表明，抗原表位距离为8.8 Å的分析物可以结合两个具有可接受空间位阻的mAb，表位距离为13.9 Å的分析物可以建立高灵敏度的夹心免疫分析法。

　　与具有最佳性能的夹心免疫分析的7A3−17B3相比，7A3−10A9和7A3−7F2(中等和低性能抗体对的代表)在不同表位距离的M−N分析物的夹心免疫分析中表现出较低的成功率(图2)。除了表位距离外，夹心免疫分析法的成功很大程度上取决于所使用的两种mAb的识别特性。因此，选择7A3−10A9和7A3−7F2来研究所选mAb对夹心免疫分析性能的重要性，并与MN7进行了三元复合物的对接和分子动力学研究。以NIA半抗原N1和N5分别制备出具有不同识别特性的mAb 10A9和7F2。与7A3−MN7−17B3三元结构类似，NIA首先对接到10A9和7F2。7A3−10A9和7A3−7F2共享空腔的表位距离分别为8.3和11.9 Å，表明10A9和NIA的结合空腔比7F2和NIA的结合空腔浅。可以假设N1半抗原中的10A9具有最短的间隔臂，由于载体蛋白的遮蔽作用，可能只能识别NIA的部分表位，然后形成一个浅的结合腔(图4f)。相比之下，半抗原N5中的7F2具有较长的间隔臂，不仅能识别NIA表位，还能识别部分间隔臂，形成深结合腔。随后，对7A3−10A9和7A3−7F2两对mAb进行分子动力学分析，得到稳定的三元复合物。因为10A9的浅结合腔导致MN7的柔性间隔臂更加暴露，10A9与NIA之间的相互作用仅发生在7A3−MN7−10A9复合物的硝基端。这导致分析物折叠，并解释了夹心免疫分析法的中等性能(图4f)。在7A3−MN7−7F2中，MN7的NIA−表位深入到7F2的结合腔中，与7F2中的D338、Q443、Y445形成氢键(图4g)。由于空间位阻，这不利于其他mAb与分析物的同时结合，导致夹心免疫分析的性能较差。结果表明，mAb的识别特性显著影响夹心免疫分析的性能，并与所设计的半抗原结构密切相关。与半抗原N4的17B3相比，间隔臂过短或过长的半抗原的10A9和7F2通常形成浅或深的结合腔，并产生空间位阻，不适用于小分子的夹心免疫分析。该研究为配对mAb的选择提供了重要的参考价值，可能有助于建立空间位阻较小的夹心免疫分析。

　　值得注意的是，本研究选择链状模式分析物是为了更直观地研究夹心免疫分析中两个表位的距离极限。因此，从研究中得到的结论可能并不完全适用于每一种小分子，以建立成功的夹心免疫分析，将在研究结束时使用真实的分析物进一步评估。

6.

　　进一步使用SPR分析验证了基于7A3−17B3对的夹心免疫分析中形成的抗体−分析物−抗体三元结构的特异性结合。首先，将mAb7A3固定在芯片上，然后，除MN1以100 μM添加外，每个M−N分析物以10 μM添加。由于MN3和MN8在PBS中的溶解度较差，因此不能用SPR进行分析。所有测试的M−N分析物在第I步表现出增加的信号，表明7A3与M−N分析物成功结合(图5a)。随着时间的推移，7A3−分析物复合物逐渐变得稳定，在步骤II中观察到不同程度的解离。随后加入mAb 17B3结合7A3−分析物复合物，在步骤III中，信号仍然显著增加，包括最小的分析物MN1。为了确认增加的信号是否是特异性的，设立了除PBS外不添加任何M−N分析物的对照组来验证两个单克隆抗体之间的结合。分析过程中PBS信号维持在基线水平，这表明两个mAb之间没有发生特异性结合，步骤III中观察到的信号增加是由17B3与7A3−分析物结合引起的(图5a)。在加入17B3后，MN1、MN2和MN4的信号轻微增加了10~20个单位，而MN6、MN7和MN9的信号则明显增加了20~40个单位，这与已建立的夹心免疫分析中M−N分析物的性能一致。此外，在浓度为1~10 μM的SPR下，MN7在建立的夹心免疫分析法中获得了最高的灵敏度。在步骤I中，7A3−MN7信号逐渐增加，在步骤II中，随着MN7浓度的增加，随后出现不同程度的解离(图5b)。在步骤III中加入17B3后，观察到7A3−分析物−17B3三元复合物的信号值升高，再次表明形成了稳定的抗体−分析物−抗体三元复合物。

　　图5.用SPR和新分析物验证夹心免疫分析 (a)除MN1(100 μM)外，每种分析物使用10 μM对7A3−被分析物−17B3三元结构进行SPR分析 (b)不同浓度MN7(1~10 μM)对7A3−MN7−17B3的SPR分析 (c)SBA−C2−NOR和SBA−C10−NOR结构;SBA和NOR部分分别用绿色和粉红色标记，间隔臂用黑色标记 (d)4D11和N2H3A8的SBA−C2−NOR和SBA−C10−NOR夹心免疫分析的标准曲线 (e) ABM结构和A表位、B表位和C表位分别用绿色、橙色和紫色标记。A与B的表位距离为6.3 Å (f)3A9和2C5对ABM的夹心免疫分析的标准曲线

7.

　　分别使用广泛应用于人类和兽医临床的典型抗菌药物SBA和NOR设计并合成了两种新型模型分析物。与M−N分析物类似，合成的SBA−C2−NOR和SBA−C10−NOR分析物属于链状分子，由SBA−表位和NOR−表位组成，表位距离分别为3.8和13.9 Å(图5c)。SBA−表位和NOR−表位的表面积分别为325.83和329.53 Å2，大约是MEL−表位和NIA−表位(分别为154.97 Å2和165.20 Å2)的两倍，因此可以作为较大表位的代表，通过建立成功的小分子夹心免疫分析来进一步验证表位距离。本课题组之前制备了抗SBA和NOR的单克隆抗体4D11和N2H3A8，并用于建立夹心免疫分析。两种模式分析物都成功建立了夹心免疫分析，SBA−C2−NOR和SBA−C10−NOR的LOD分别为0.30和0.02 nM(图5d)。结果表明，即使表位距离较短，小分子也可以实现成功的夹心免疫分析。分析物的表位距离对夹心免疫分析法灵敏度的影响也被进一步研究。表位距离为建议的13.9 Å的SBA−C10−NOR的夹心免疫分析LOD比表位距离为3.8 Å的SBA−C2−NOR低10倍以上(图5d)。此外，对于两种模式分析物，与竞争免疫分析相比，夹心免疫分析在灵敏度和检测范围上具有明显优势，特别是对于SBA−C10−NOR，LOD提高了近30倍。结果表明，即使超过2.4 Å的极短表位距离，具有较大表位的小分子也可以实现灵敏的夹心免疫分析。

　　使用环状真实分析物ABM(一种广泛用于农业害虫控制的大环内酯杀虫剂)进一步验证了小分子的夹心免疫分析。设计了半抗原ABM−A(之前由本实验室制备)和ABM−B，并通过在ABM的4”−OH和5'−OH引入间隔臂，分别与载体蛋白KLH偶联作为免疫原制备mAb(图5e)。在对mAb进行大量筛选和配对后，将半抗原ABM−A产生的3A9与半抗原ABM−B产生的2C5配对，建立了ABM的夹心免疫分析，LOD为1012.1 nM(图5f)。夹心免疫法检测ABM的低灵敏度可能是由于抗体结合位点重叠造成的空间位阻，降低了各mAb与ABM的结合能力。ABM的结果表明，需要仔细的半抗原设计和广泛的mAb筛选，以建立高灵敏度的夹心免疫分析。本研究表明，小分子检测的夹心免疫分析并不总是具有优势，这在很大程度上依赖于靶标分析物的结构和最佳抗体对。使用真实分析物的这些结果证明，具有一定表位距离的小分子可以用夹心免疫分析法检测。

【结论与展望】

　　因为小分子不能同时被两种抗体结合，通常不采用直接的夹心免疫分析法进行检测。本研究证明了通过夹心免疫分析可以检测到由两个表位(仅相隔2.4 Å)组成的相对较小的分子。通过实验和理论研究发现，对于两个表位之间的距离为8.8 Å的表位，夹心免疫分析法的成功率很高。这些结果表明两个mAb与表位距离很短的分析物可以结合形成三元复合物。超长表位距离的高灵活性可能会降低这些抗体−分析物−抗体复合物的稳定性，降低夹心免疫分析的灵敏度。此外，具有超长或短间隔臂的半抗原诱导的具有深或浅结合腔的抗体不利于小分子夹心免疫分析的验证。本研究的数据能够引起免疫分析领域的广泛关注，为成功建立灵敏度、检测范围和特异性更高的小分子夹心免疫分析提供可靠的参考。

【原文出处】

　　Bai, Y., Fei, J., Wu, W., Dou, L., Liu, M., Shao, S., ... & Wang, Z. (2022). Minimum Distance Between Two Epitopes in Sandwich Immunoassays for Small Molecules.

　　原文链接：https://chemrxiv.org/engage/chemrxiv/article-details/62562eb4ed4d88c13a087014

　　指导教师：王战辉