研发阶段常用His标签，最终上市蛋白药一般不建议保留His-tag，除非有非常充分的必要性和完整风险证明。

1. 研发/早期筛选阶段：可以加His标签

His-tag常用于重组蛋白表达、纯化和检测，优点是标签小，常见His₆约0.8 kDa，可用亲和层析快速纯化。适合早期构建筛选、活性初筛、结构分析样品制备，方便 Western blot、ELISA 或捕获检测，所以如果只是做候选分子筛选、工艺摸索、抗原制备、体外活性研究，His标签可以作为一个非常好用的工具。

2. 最终蛋白药成品：通常不建议保留His标签

如果His-tag是最终给人用的药物分子的一部分，就会变成一个外源非天然序列，需要作为产品结构的一部分进行充分论证。监管上，生物技术/生物制品需要对蛋白的结构、纯度、杂质、污染物、生物活性和免疫化学性质等建立质量标准，ICH Q6B/FDA指南也强调这些项目是上市申报质量控制的重要内容。 

His标签的主要风险有哪些呢?

①免疫原性风险：His-tag可能引入新的B/T细胞表位，改变蛋白构象、暴露表位、聚集倾向，从而增加ADA风险。FDA也指出，蛋白类治疗药物的免疫原性是关键安全性和有效性问题，抗药抗体可能降低或消除疗效，也可能带来严重并发症。 EMA 的治疗性蛋白免疫原性指南也把产品相关因素、抗药抗体、疗效和安全性影响列为核心评估内容。

②结构和功能风险：His-tag虽然小，但仍可能影响：受体结合、酶活性、蛋白折叠、二聚/多聚状态、稳定性、聚集、半衰期、糖基化附近构象，若靠近糖基化区域或功能结构域，尤其是细胞因子、酶、受体配体、融合蛋白等，对末端结构比较敏感。

③工艺和质量控制风险：如果保留His-tag，CMC上需要额外证明标签序列完整且批间一致、标签不会被剪切或降解、不形成异常电荷异构体、不增加金属离子残留风险、不影响活性、纯度、稳定性、与临床批次质量属性一致。此外，若使用 Ni-NTA 纯化，还要关注镍/钴等金属离子残留以及咪唑残留控制。

3. 更推荐的策略：His-tag只用于工艺开发，最终切除

如果确实需要His-tag辅助纯化，推荐设计为：目标蛋白- linker –酶切位点- His-tag或：His-tag–酶切位点-linker-目标蛋白。常用切除位点包括 TEV、HRV 3C、Thrombin、Factor Xa 等。此外，切除后需要建立方法确认，标签完全去除、游离His-tag 去除、蛋白酶去除、未切除融合蛋白残留受控、切割后 N/C 端序列符合预期、活性和稳定性不受影响。

4. 什么时候可以考虑最终保留His-tag？

理论上不是绝对禁止，但需要非常强的科学理由，比如：His-tag 是药效机制的一部分、His-tag对分子稳定性、定位、递送或功能不可替代、去除后活性或可制造性显著下降、已完成充分的非临床和临床免疫原性、PK/PD、安全性桥接证明。例如，已上市的贝林妥欧单抗（Blinatumomab）药物就在蛋白序列的C端保留的His标签。但从蛋白药开发的保守策略看，能不保留就不保留。

小编总结：

作为研发和纯化工具，可以加 His 标签；若目标是蛋白药成品，通常应去除His-tag。如果最终产品必须保留 His-tag，需要把它当成药物分子结构的一部分，系统评估免疫原性、活性、稳定性、PK/PD、安全性和质量一致性