免疫层析法看似简单，其实里面还有很多没有解决的问题。能够搞明白其中的一些科学问题，或者做出一些有价值的实际应用出来，一定是我们快检人的目标了。作为刚入行快检一年的小萌新，在下面罗列了关于免疫层析的一些问题和个人的理解，希望大家在评论区一起思考和讨论吧。

　　抗体制备

　　1 、用什么与半抗原偶联合适，为了增强半抗原的免疫原性，通常使用BSA和KLH，可以考虑其它蛋白质类载体，或者利用多糖类载体，与佐剂配合使用增强免疫效果。

　　2 、如何通过原药设计半抗原，产生的抗体一定源于希望的识别位点吗?碳链长度多少合适?太长可能折叠，太短可能被蛋白遮蔽，文献显示6-8个碳链比较合适。

　　3 、对于免疫佐剂的使用，为了增强免疫效果，通常使用弗式佐剂，但是乳化过程十分剧烈，对于不稳定的抗原可能导致解离，可以考虑使用矿物盐类和多糖类亲水佐剂。

　　4 、通常需要四免甚至五免才有较好的抑制，周期过长，能否通过增加免疫剂量或者缩短每次免疫之间的间隔，从而缩短免疫周期。

　　5、 细胞融合时，小鼠的脾脏大小差异很大，导致脾细胞的数量差异很大，是否可以通过调节饮食或者环境使小鼠具有更多的脾细胞?

　　6、 通常用PEG诱导融合，得到一定比例的杂交瘤细胞，需要用HAT培养基进一步筛选，其它融合手段如电融合能否提高杂交瘤细胞的比例?

　　7、 通常采用有限稀释法进行亚克，筛选阳性细胞步骤繁琐且周期较长，可以借助一些设备，如流式细胞仪等进行筛选。

　　8 、杂交瘤细胞稳定性较差，传代过程中可能发生染色体丢失，导致亚克得到的阳性细胞株转阴，除了连续进行两到三轮亚克或者及时冻存阳性细胞株之外，还有什么办法可以避免转阴?能否通过加入维持杂交瘤细胞遗传稳定性的物质?

　　材料合成

　　9 、通常选择对激发光的吸收更好和量子产率更高的荧光材料，从而具有更高的荧光强度，能够提高免疫层析法的灵敏度，但是方法的灵敏度和材料的荧光强度之间有什么具体的关系?

　　10 、增强聚集诱导发光材料的共轭程度，会使材料的发射峰红移，通常能够降低背景干扰，这个背景一部分是基质，比如豇豆本身具有绿色的荧光，还有哪些情况是背景干扰呢?

　　11 、光激发使材料中的电子发生跃迁，通过辐射跃迁到基态便产生荧光，通过非辐射跃迁到基态便产生光热，所以通常荧光和光热的双功能都是复合材料，且荧光存在被光热材料淬灭的风险，是否存在一种材料能够平衡荧光和光热的特性?

　　12 、不同材料具有不同的特性，比如金的比色和光热，AIE和量子点的荧光，纳米酶的催化，Fe3O4的磁性，将这些材料复合后便具备了多重特性，复合材料的某种特性可以不需要优于单个材料，只要优于传统材料就行。

　　抗体标记

　　13 、看似简单的抗体标记过程，其实有很多的讲究和方法，有的材料可以通过静电吸附标记，有的带羧基的材料可以通过EDC法标记，有的材料需要包覆一层物质辅助标记，如PDA和MPN。

　　14、 不同标记方法影响很大，如何确定最适合于材料的标记方法?

　　15 、哪些材料可以用静电吸附标记?除了材料本身之外，缓冲液的电导率影响也很大，在电导率高的缓冲液中更容易标记上。

　　16、 EDC法标记包括一步法和两步法，两种方法分别具有哪些优势和不足?

　　17 、EDC法是利用EDC和NHS活化羧基，使其更容易与抗体偶联，微球之间的距离比较近，其实有很大比例的抗体是通过静电吸附到微球表面的。

　　18、 标记过程的缓冲液有很多讲究，缓冲液的电导率会影响抗体在微球表面的吸附，缓冲液的pH也是抗体能否标记上的关键因素，且缓冲液不能影响抗体的生物活性。

　　19、 封闭步骤能够封住微球表面除了抗体偶联的其它地方，防止非特异性产生，多少封闭剂能够尽可能多的封住，过多封闭剂是否会相互交联而遮蔽抗体的结合位点?

　　20 、通常封闭剂使用酪蛋白和BSA，还有哪些物质可以用作封闭剂且封闭效果更好?

　　21 、材料在偶联前和偶联过程中需要超声，使材料分散更均匀，不同材料需要优化超声时间，超声时间过长容易影响抗体偶联效果。

　　22 、随着标记时间增长，抗体偶联率会逐渐增加，到一定时间后有一个饱和值，对不同材料和不同抗体的最佳的标记时间需要摸索。

　　免疫层析

　　23 、能否通过调整样本垫、结合垫、NC膜、吸水纸的材质和黏贴位置，使样本的流速尽可能的匀速以降低CV值。

　　24 、小孔径的NC膜上样本的流速较慢，抗原抗体具有更长的结合时间，但是大粒径的材料容易堵膜，需要换大孔径的NC膜。

　　25、 为了使样本具有更慢的流速，有研究设计的一种专门用于试纸条的离心机，通过与层析作用反向的离心力，使样本流速更慢，也可以利用重力作用，在层析过程中将试纸条倾斜一定的角度。

　　26 、对于荧光物质作为标记材料，传统试纸条白色的底板会有背景干扰，有研究设计了一种黑色底板，能够消除这种背景干扰。

　　27 、环境因素对免疫层析过程具有非常大的影响，不同的温度和湿度都可能造成结果的不可重复性。

　　28 、试纸条的稳定性实验通常是测试在不同温度下的保存时间，湿度理应成为考虑因素。

　　29 、有时候观察到的堵膜现象，不一定是微球粒径太大导致的，可能是样本溶液的黏度较大导致吸水纸对其的吸引作用不够，加入一定量的表活可以缓解。

　　30、 有时候在ELISA上抑制很好的抗体，在试纸条上的抑制很差，除了抗原抗体的结合时间不够之外，还有什么其它原因?

　　31、 T线上抗原或抗体的喷量会直接影响信号值和方法的灵敏度，之间有没有规律可循?

　　32 、通过调整C线上二抗的喷量，可以调整方法的灵敏度。

　　33 、检验单一靶标物时，C线通常喷二抗，信号值利用T/C值输出，联检多个靶标物时，C线可以喷其它抗体，信号值利用T值输出。

　　34 、通常情况下灵敏度越高线性范围越窄，灵敏度越低线性范围越宽，这是偶然导致的吗，之间有没有什么数学联系?

　　35、 和液质联用方法对比，免疫层析法通常CV会较大，尤其是灵敏度很高时CV更大，这种情况是方法本身的缺陷还是有其它的原因?

　　36、 液质联用通过将母离子打散成不同子离子，能够实现对不同同分异构体的检测，而免疫层析法暂时无法做到检测同分异构体，有没有可能能够解决这个问题?

　　37、 检验大分子靶标物时，浓度高导致的hook效应能够如何解决?

　　38、 抗体偶联的标记材料通常喷在结合垫上，随着样本溶液流动，有多少能够溶解于样本溶液中并结合其中的靶标物，如何提高这种比例?

　　39、 提高方法灵敏度的目的除了能够检测到更低浓度的靶标物之外，在稀释的过程中，其它杂质的含量也在降低，从而能够在一定程度上降低基质干扰。

　　40、 跑条子的样本稀释液应该如何选择?通常使用PBST，PBS缓冲液是为了维持抗原抗体结合的活性，Tween是为了让样本溶液更好的流动，但是经验表明纯水配自来水可能具有更好的效果，其中存在什么科学依据吗?