侧流免疫层析技术(LFIA)被广泛用于黄曲霉毒素B1(AFB1)等霉菌毒素的快速检测。然而，传统的LFIA高度依赖抗原，导致生产成本高且存在健康风险。本研究开发了一种纳米抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(AP2-5)作为AFB1分析中抗原的替代品。碱性磷酸酶(AP)在溶液中可自发组装成二聚体，形成具有更高亲和力的二价纳米抗体。通过铜离子取代氧空位和单宁酸包封的方法成功合成一种新型双模态信号示踪剂Cu-MoOx纳米颗粒(CMO)。该示踪剂表现出优异的水分散性、比色强度、光热转换效率(η = 45.58%)及抗体偶联效率(79.10%～94.68%)。利用此CMO平台，开发了一种比色/光热双模式LFIA(CM-LFIA/PT-LFIA)，用于食品中AFB1的快速灵敏检测。该系统的检测限(LOD)低至0.0191 ng mL⁻¹，并在玉米、燕麦和大豆样品中实现了85.07%至117.03%的回收率。

　　霉菌毒素广泛存在于食品和饲料中，其中黄曲霉毒素 (AF)，尤其是AFB1，是毒性最强的霉菌毒素之一。传统的AFB1检测方法，如高效液相色谱 (HPLC)、液相色谱-串联质谱 (HPLC-MS/MS)和四极杆飞行时间质谱 (TOF/Q-TOF MS/MS)，虽然灵敏度高、准确性好，但操作步骤复杂且仪器昂贵，无法满足食品质量控制中实时检测的需求。其他一些快速灵敏的检测方法如酶联免疫吸附测定 (ELISA)、电化学传感和CRISPR/Cas技术也已出现。其中，侧流免疫层析法 (LFIA) 因对实验室条件依赖度低且无需专业知识而脱颖而出。

　　比色/光热双模式LFIA (CM/PT-LFIA) 因其高信号强度、快速响应和强稳定性具有巨大应用前景。其成功依赖于具有强光热转换性能的材料。钼基氧化物以其热催化活性而闻名，例如，负载银纳米立方体的三氧化钼 (MoO3) 纳米片表现出改善的光热响应。此外，纳米结构的形貌也起着关键作用，对称性粒子如纳米球和纳米立方体显示出增强的吸收和共振效应，进一步提高了光热效率。目前用于AFB1的LFIA通常使用固定在试纸条上的抗原 (AFB1-BSA) ，这种方法成本高且对环境有害。噬菌体展示肽技术可产生模拟AFB1的肽，以与一抗的结合位点结合。抗独特型纳米抗体的单域结构便于进行基因工程改造，先前研究表明，AP的二聚化特性有助于增强其结合纳米抗体的亲和力，并高效结合目标抗原。

　　在先前的研究中，我们成功构建了碱性磷酸酶-纳米抗体融合蛋白(AP2-5)，并将其用作黄曲霉毒素衍生的替代抗原。通过一步法合成富含氧空位和单宁酸的绿色改性材料，并将其与AP2-5一起应用于免疫分析。在免疫分析中，CMO-mAbsAFB1抗体特异性结合包被了AP2-5的检测线 (T线)。当样品中不含游离AFB1时，由于抗体-抗原识别作用，抗体会聚集在T线，导致阴性检测结果。随着样品中AFB1浓度的增加，T线逐渐变浅(CM模式下的定性评估)或反应温度降低(PT模式下的定量评估)。该免疫平台不仅拓宽了纳米抗体的应用视野，也推动了环保型霉菌毒素免疫传感器的发展。

　　1.CMO的合成与表征

　　通过一步水热法(图 1A)，采用金属-多酚配位策略将Mo和Cu以离子态形式引入，成功合成了CMO纳米花。透射电子显微镜(TEM)图像显示，合成的CMO呈现出不均匀分布的复合纳米结构图像，具有类似花瓣状的特征(图 1B)。这些纳米结构的平均直径约为150 nm，与粒度分析仪的观察结果一致(图 1E)。进一步的光谱分析证实了CMO中存在关键元素，包括C、O、Cu和Mo，且Cu和Mo在纳米结构中分布均匀(图 1C)。

　　CMO的粉末X射线衍射图谱(图 1F)与四方相MoO2的标准峰(JCPDS No. 02–0422)高度吻合，但未观察到明显的Cu相关衍射峰。在2θ值为26.033°、37.120°和53.546°处的特征衍射峰分别对应于(110)、(101)和(211)晶面，进一步支持了Mo结构的完整性。元素组成通过X射线光电子能谱(XPS)得到进一步验证(图 1H)，其结果与能量色散X射线光谱(EDS)获得的结果一致。在Mo 3d谱中，236.2 eV和233.1 eV处的峰被确定为Mo⁶⁺、Mo⁵⁺和Mo⁴⁺氧化态的特征峰(图 1I)。同样，Cu 2p₃/₂谱显示主要为Cu²⁺和Cu⁺氧化态。此外，对O 1s XPS谱的深入分析(图 1J)识别出CMO中存在大量的氧空位，这与之前的研究结果相符。

　　CMO在未经任何修饰的情况下，对黄曲霉毒素B1单克隆抗体(mAbs)1C11表现出显著的结合亲和力。当用抗AFB1单克隆抗体1C11进行功能化修饰后，观察到CMO的ζ-电位显著增加，从原始值-31.1 mV变为-16.7 mV(图 1D)。这种显著的静电位移表明CMO通过特异性静电相互作用与抗体紧密结合，证实了结构明确的CMO-mAbs探针的形成。

　　图 1. CMO 的表征。(A) CMO 的合成流程图;(B) 透射电子显微镜图像;(C) HAADF 图像及 EDS 元素分布图;(D) AuNPs 和 CMO 在偶联 mAbs 前后的 Zeta 电位;(E) 粒径分布统计图;(F) 粉末 XRD 谱图;(G) CMO 和 MoOx-NPs 的紫外吸收光谱;(H) XPS 谱图;(I, J) CMO 在 Mo 3d 和 O 1s 区域的高分辨率 XPS 谱图。

2.CMO光热性能评估

　　相同浓度下收集了CMO和MoOx纳米颗粒的紫外吸收光谱(图 1G)。CMO在808 nm处表现出宽泛的吸收，初步表明CMO可用作LFIA的光热转换剂。使用近红外激光(808 nm, 2 W cm⁻²)照射5分钟，评估了不同浓度CMO的光热转换行为。结果表明，CMO溶液浓度(0–500 μg mL⁻¹)与产生的升温效应之间存在良好的正相关性，显示出改善的光热吸收性能(图 2A)。如图 2B所示，在所有浓度下，可达到的最高温度为60.1 °C，且温度随时间逐渐升高并随后趋于稳定。此外，在300 μg mL⁻¹的浓度下，温升表现出对激光能量密度(0.5–2 W cm⁻²)的明显依赖性，在2 W cm⁻²下观察到更显著的升温效应(图 2C)。

　　为了进一步研究CMO的光热循环行为，选择了300 μg mL⁻¹的CMO以及相同浓度的MoOx纳米颗粒样品进行测试。在四次激光开关辐照循环过程中，CMO的最高温度基本保持不变，表明其信号重现性良好(图 2F)。最后，为了确定CMO的光热性能，我们测量了CMO和蒸馏水的一个光热循环，计算出其光热转换效率(η)约为45.58%(图 2D)，这相比相同浓度的MoOx纳米颗粒(29.72%，图 2E)有显著提升。

　　为了进一步探究CMO优异的光热性能，我们从Cu掺杂的有无角度对其进行了分析，并利用时域有限差分法 (FDTD)模拟了在808 nm激光照射下，CMO和MoOx-NPs在其三维空间中的电场分布。如图 2H所示，MoOx-NPs的电磁热点区域仅限于边缘区域，且强度较低。相比之下，CMO的热点密度显著增强，特别是在花瓣尖端区域，该处的电场强度最大(图2G)。这归因于尖端对电场增强潜能的贡献，这将为LFIA的发展提供更具前景的示踪剂。

　　图 2. CMO 的光热性能。(A) 不同浓度 CMO 的热成像图及 (B) 光热升温曲线 (808 nm, 2.0 W cm⁻²);(C) 不同激光功率照射下 CMO 的光热升温特性 (300 μg mL⁻¹);(D) CMO 和 (E) MoOx-NPs 在经历一次 808 nm 激光开关循环照射后的温度曲线，以及冷却时间与温度驱动力的负自然对数关系图;(F) CMO 和 MoOx-NPs 在四次激光开关辐照循环 (808 nm, 2.0 W cm⁻²) 期间的升温和降温曲线;(G) CMO 和 (H) MoOx-NPs 在 808 nm 近红外光照射下的近电磁场分布图。

　　3.免疫探针性能测定

　　Nb2-5是一种抗独特型纳米抗体，通过将抗AFB1单克隆抗体1C11注射到羊驼体内构建的免疫噬菌体展示纳米抗体库获得。使用AP2-5作为包被底物测试五种不同浓度的抗体与等量CMO和AuNPs的偶联情况。通过间接ELISA法建立了OD450 nm吸光度与抗体浓度之间的关系(图 3B)。选择五种浓度的抗体进行探针孵育，根据标准曲线获得上清液中剩余的抗体量，并通过公式计算抗体偶联效率。在一致的抗体和材料浓度条件下，与AuNPs(54.57%–78.10%，图 3D)相比，CMO与mAbs的偶联效率(79.10%–94.68%，图 3C)表现出显著更高的性能。两种材料的抗体偶联效率均随着抗体浓度的升高而呈现下降趋势，与AuNPs相比CMO的下降速率明显更慢，凸显了CMO优异的抗体结合效率，强调了其作为构建LFIA的理想纳米标记材料的选择。

　　通过间接竞争ELISA法评估了抗原替代物(AP2-5和 Nb2-5)与抗AFB1 mAbs之间的亲和力。如图 3E 和 3F 所示，确保AP2-5和Nb2-5浓度相同的条件下，通过间接ELISA测试了吸光度与抗体浓度的曲线。此曲线用于确定抗原与抗体之间的结合亲和力，表示为Ka。从图 3G 可以看出，AP2-5的Ka值(7.80 × 10⁹ M⁻¹)比Nb2-5的Ka值(1.46 × 10⁹ M⁻¹)高出5倍以上。这可能归因于AP的同源二聚体特性。抗原替代物增强的亲和力使其在LFIA应用中具有显著优势。

图3.CMO 与 mAbs 偶联效果及融合蛋白性能评估。(A) CMO 和 AuNPs 与单克隆抗体偶联过程示意图；(B) AP2-5 的 OD450nm 值与抗 AFB1 mAbs 浓度的回归方程；CMO (C) 和 Au NPs (D) 与 AP2-5 的偶联效率评估（组 1–5 分别对应抗体添加量为 5、10、15、20 和 25 μg）；Nb2-5 (E) 和 AP2-5 (F) 与单克隆抗体的亲和力测定；(G) AP2-5 和 Nb2-5 的 Ka 值比较。

　　4.实验条件优化

　　为确保检测过程的可靠性并防止假阴性结果，我们采用检测线 (T线) 强度和阳性结果(8 ng mL⁻¹)作为主要评估标准。运行缓冲液被确定为影响探针与T线抗体结合的关键因素。经过充分优化，发现在各种缓冲溶液中，PBS表现出最高的T线强度。CMO浓度显著影响双模式LFIA的性能。在0.4–1.2 mg mL⁻¹范围内，T线值随着CMO浓度的增加而显著增加。然而，过高的浓度会导致假阴性结果。因此，确定1 mg mL⁻¹ CMO为最佳浓度。孵育pH值对于探针与抗体成功偶联至关重要。在孵育过程中添加60 μL K₂CO₃时获得了最佳结果。此外，为增强灵敏度，研究了抗体添加体积 (3–7 μL, 1 mg mL⁻¹)。信号强度随着抗体用量的增加而逐渐增加并趋于稳定，最终选择6 μL作为最佳添加体积。探针体积在检测中也起着重要作用。T线颜色深度随着探针体积的增加而加深，在15 μL(最佳体积)时达到一致的色深。免疫反应时间优化为15分钟，以实现检测效率和特异性之间的最佳平衡。

　　5.LFIA灵敏度评估

　　根据竞争性免疫分析原理，随着AFB1浓度的增加，它会与溶液中的探针结合，导致结合到T线(AP2-5)上的探针减少。通过CM和PT两种信号为样品中AFB1提供更可靠的定量。在CM模式下，T线的灰度值随着AFB1浓度的增加而降低(图 4A)。其目视检测限 (vLOD)和检出临界值 (COV)分别为0.8 ng mL⁻¹ 和 1.6 ng mL⁻¹，并在灰度值与AFB1浓度之间建立了标准曲线。值得注意的是，计算得出的检测限 (LOD)为0.0266 ng mL⁻¹，并且在0.04–0.2 ng mL⁻¹的AFB1浓度范围内，T线响应表现出良好的线性关系，回归方程为 y = 6474.49 − 20241.90x (R² = 0.980, 图 4D)。

　　在PT模式下，随着AFB1浓度的增加，T线的热成像图颜色从白色变为红色，表明温度持续降低(图 4B)。光热反应的vLOD和COV分别为0.4 ng mL⁻¹ 和 1.2 ng mL⁻¹。CMO优异的光热转换效率使其在0.04–0.2 ng mL⁻¹的AFB1浓度范围内呈现出良好的线性(y = 28.12 − 65.23x)，检测限 (LOD)为0.0191 ng mL⁻¹，R² = 0.980(图 4E)。与比色结果相比，光热模式的检测性能提高了约1.39倍。

　　此外，在理想条件下评估并优化了AuNPs介导的LFIA (AuNPs-LFIA)的分析性能。AuNPs-LFIA的最佳条件包括K₂CO₃添加体积(2.5 μL)和抗体体积(4 μL)。图 4C显示了AuNPs-LFIA在0–6.66 ng mL⁻¹ AFB1浓度范围内的检测性能，其vLOD和COV分别为1.33 ng mL⁻¹ 和 2.66 ng mL⁻¹。AuNPs-LFIA的检测限 (LOD)为0.327 ng mL⁻¹。T线灰度强度在0–0.66 ng mL⁻¹范围内与AFB1浓度呈现良好的线性关系，回归方程为 y = 6929.78–6717.85x (R² = 0.982, 图 4F)。基于这些结果，CMO-LFIA对AFB1检测的定量灵敏度显著增强。具体而言，与AuNPs-LFIA相比，其灵敏度在比色模式下提高了约4.53倍，在光热模式下提高了约6.30倍。

　　图 4. CMO-LFIA 用于 AFB1 检测的分析性能评估。(A) 基于 CMO 在 0–2 ng mL⁻¹ AFB1 浓度下的比色检测图像;(B) 光热检测图像;(C) 基于 AuNPs 在 0–6.66 ng mL⁻¹ AFB1 浓度下的比色检测图像;(D–F) 对应于三种检测方法的校准曲线。插图：对应于三种检测方法的线性响应;(G) CMO-LFIA 在比色和光热模式下检测 AFB1 的特异性评估;(H) 比色和光热模式下 T 线的灰度值和 ΔT;(I) 使用双模式 CMO-LFIA 免疫传感器对燕麦片、玉米和大豆中 AFB1 的分析(数值表示为平均值，n = 3)。

　　本研究成功开发了一种高效的CMO-LFIA用于AFB1检测，该方法融合了由融合蛋白AP2-5介导的双模态比色与光热检测策略。在检测线(T线)上固定二价融合蛋白AP2-5作为抗原的替代物，从而实现了极低的检测限(0.0191 ng mL⁻¹)和优异的回收率(85.07%–117.03%)。此外，在CMO设计中引入单宁酸包封和缺陷工程显著提升了其性能，而纳米抗体的使用则为谷物中AFB1的检测提供了一种可持续且经济高效的解决方案。这种双信号检测策略不仅利用了两种模式的互补优势，而且与单信号检测相比，提供了更精确、更可靠的分析结果。