背景“星空图”：膜上布满非特异性斑点，比银河还耀眼。
如果你也经历过以上“惨案”，别慌！这篇保姆级攻略将带你从原理到实操，彻底征服WB实验！
一、Western Blot实验基本原理
Western Blot（蛋白免疫印迹）是检测特定蛋白表达的“黄金标准”！
基本原理：先利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术对蛋白质样品进行分离，使不同分子量的蛋白质在凝胶中按大小排列。随后，通过合适的转移方法（如电转移），将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相载体（如硝酸纤维素膜（NC 膜）或聚偏氟乙烯膜（PVDF 膜））上。固相载体凭借其独特的物理化学性质，以非共价键形式吸附蛋白质，且能最大程度维持电泳分离后多肽的原有形态以及生物学活性。
接下来，将固相载体上的蛋白质作为抗原，与特异性的抗体发生免疫反应。首先加入一抗，它能够精准地识别并结合到目标蛋白上。之后再加入标记有酶或放射性同位素的二抗，二抗与一抗特异性结合。最后，通过底物显色或放射自显影技术，使反应位点产生可见的信号，从而检测出电泳分离后的特异性目的蛋白，实现对特定基因表达蛋白成分的分析。
二、实验流程图
1、提取 ：从细胞或组织中提取蛋白质时，需使用裂解液（如 RIPA 裂解液），并加入蛋白酶抑制剂（如 PMSF）和磷酸酶抑制剂，以防止蛋白质降解和去磷酸化。将裂解后的样品进行离心（一般为 10,000 -14,000g，4℃，10 - 20 分钟），取上清液即为蛋白提取液。
①常用的RIPA缓冲液(强)配方: 1%NP-40或Triton X-100，1% sodiumdeoxycholate，0.1% SDS，150 mM NaCl，50 mM Tris-HCl，pH 7.4，1mMEDTA。
2、定量 ：常用的蛋白定量方法有 BCA 法和 Bradford 法。
BCA 法通过比色法测定蛋白质浓度，操作时需准确配制试剂工作液，并确保反应体系的温度和时间一致。
Bradford 法利用考马斯亮蓝 G - 250 染料与蛋白质结合后的颜色变化来测定浓度，此方法操作简便，但易受蛋白质种类和缓冲液成分的影响。
通常将 BSA（牛血清白蛋白）配制成 2mg/mL 的母液，然后进行梯度稀释，得到 0.5-2.0mg/mL（5 个点）的标准品溶液，这是常见的梯度范围。
一般将样本稀释 1:10~1:50，但具体稀释倍数需要根据样本的大致蛋白浓度进行调整，确保 OD 值在标准曲线的线性范围内。
BCA 工作液的配制通常是将试剂 A 和试剂 B 按 50:1 的比例混合，然后加入到标准品和样本中，37℃孵育 30min，这个步骤正确。
在 562nm 波长下读取 OD 值，这是正确的检测波长。
如果样本未稀释直接检测，确实可能导致 OD 值超出仪器的检测范围。解决方法是将样本进行适当稀释，使其 OD 值落在标准曲线的线性范围内，然后重新检测。
移液枪操作误差是导致标准曲线 R² 值过低的常见原因之一。可以尝试换用反向吸液法来减少误差，这种方法可以更精确地控制液体的吸入和释放。此外，确保标准品的配制准确、孵育条件一致以及比色杯的清洁等也非常重要。
①移液操作 ：移液枪的使用要规范，定期校准移液枪，确保移液的准确性。
②反应条件 ：孵育时间和温度要严格控制，过长或过短的孵育时间以及温度的波动都可能影响检测结果。
③比色杯 ：使用比色杯时，要注意其清洁度，避免因比色杯上的污渍或划痕影响光吸收的测量。
④试剂新鲜度 ：BCA 试剂要保证新鲜，避免长时间存放导致试剂失效。
根据目标蛋白分子量选择合适的聚丙烯酰胺凝胶浓度。配胶时，需准确称量各种试剂，如丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED 等，并用适量的蒸馏水溶解。注意避免溶液中产生气泡。
凝胶浓度选择不当可能影响蛋白质的分离效果。浓度越高，凝胶孔径越小，适合分离小分子量蛋白；反之，则适合大分子量蛋白。若配胶过程中试剂混合不均匀或产生气泡，会影响凝胶的均匀性和电泳效果。
将蛋白样品与上样缓冲液（含 SDS 和巯基乙醇）混合后，加载到凝胶孔中。使用垂直电泳装置，在适当的电压下进行电泳。一般来说，浓缩胶部分使用较低电压（如 80V），分离胶部分使用较高电压（如 120 - 150V）。
电泳时间过长或过短，以及电压过高或过低，都会影响蛋白质条带的质量和分离效果。时间过长可能导致条带跑出凝胶，时间过短则会使条带过于拥挤。电压过高可能使蛋白质变性不充分，电压过低则会延长电泳时间。
浓缩胶 ：80V 恒压，时间约为 30min，至溴酚蓝迁移至浓缩胶与分离胶交界处，开始进入分离胶。
分离胶 ：120V 恒压，时间根据目标蛋白的分子量和电泳情况调整，一般为 1 - 2 小时。
制胶气泡 ：在倒入分离胶时，应将玻璃板轻轻靠在一块小木板或玻璃片上，呈 45° 倾斜，缓慢注入分离胶，这样可以使气泡沿斜面逸出，避免气泡混入胶中。注入完成后，将玻璃板轻轻放平，使分离胶自然铺平。若分离胶中存在小气泡，可用电泳缓冲液或细针将其挑出。
条带扭曲 ：每块胶的电流应控制在 15 - 25mA 左右。电泳时缓冲液需完全覆盖胶面，否则会导致电流分布不均，使蛋白质迁移速度不一致，造成条带扭曲。此外，确保电泳槽内缓冲液充足且电极连接正确，避免电泳过程中出现局部过热或电流过大等情况，也有助于防止条带扭曲。
将经过电泳分离的蛋白质从凝胶转移到固相载体（如 PVDF 膜或尼龙膜）上。转膜前需对膜进行活化，PVDF 膜通常用甲醇浸泡。在转膜装置中，按顺序放置滤纸、凝胶、膜和滤纸，并确保它们之间没有气泡。使用湿转装置，在适当的电流和电压下进行转膜（一般为 200 - 250mA，30 - 60 分钟）。
转膜效率低会导致部分蛋白质无法转移到膜上，从而在后续检测中出现条带缺失或强度过低的情况。转膜过程中如果电流过大，可能会使蛋白质变性或破坏膜的结构。气泡的存在会阻碍蛋白质的转移，导致转膜不完全。
用封闭液（如 5% 的脱脂奶粉或 BSA 溶液）封闭膜上的非特异性结合位点，以防止抗体的非特异性吸附。封闭通常在室温下进行，时间为 1 - 2 小时。
封闭不充分可能导致抗体的非特异性结合，增加背景信号。过度封闭可能会阻碍抗体与目标蛋白的结合，导致信号过低或无信号。
一抗孵育 ：将封闭后的膜与特异性一抗在适当条件下孵育（如 4℃孵育过夜）。一抗浓度一般较低，需根据抗体说明书进行稀释。
洗涤 ：用 TBST 缓冲液洗去未结合的一抗，减少背景信号。洗涤步骤通常包括 3 - 5 次，每次 5 - 10 分钟。
二抗孵育 ：加入与一抗相应的二抗（通常标记有酶或荧光物质），在室温下孵育 1 - 2 小时。二抗浓度相对较高，也需根据说明书稀释。
常用的检测方法包括化学发光检测和荧光检测。化学发光检测使用 ECL 试剂，二抗标记的酶催化底物发光，发光强度与目标蛋白的量成正比。通过 X 光胶片或成像仪记录发光信号。荧光检测则使用荧光成像仪直接检测二抗标记的荧光信号。
化学发光检测中，底物变质或酶失活会导致发光信号减弱或无信号。荧光检测中，荧光信号可能受到背景荧光的干扰，影响检测结果的准确性。此外，曝光时间不当也会影响显影效果，时间过短信号弱，时间过长可能出现过曝现象。
1. 蛋白定量篇：为什么测不准？
案例：BCA法测出负值？
→ 罪魁祸首：样本含高浓度EDTA
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